PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 里氏埃里希氏體探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Ehrlichia risticii | 貨號 | YSP96643 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團,3'端標(biāo)記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 肝素鋰Mouse Inrferon-γ (mIFN-γ)氟 促胰液素;胰泌素p62Dok Antibody二乙氧烷 麝香草酚Tropomyosin-1/3 (D17B8) Rabbit mAb1,二甲基-哌啶酮 普拉洛芬Olfm4 (D6Y5A) XP® Rabbit mAb (Mouse Specific)亞硝酸正戊酯 普拉洛芬(標(biāo)準(zhǔn)品)Olfm4 (D6Y5A) XP® Rabbit mAb (Mouse Specific)亞麻酸 牛血清白蛋白(BSA);牛血清白蛋白組分五p56Dok-2 Antibody對氯乙酰 萘啶酮酸;萘啶酸CD45 (HI30) Mouse mAb (redFluor™ 710 Conjuga)乙氧甲酰-哌酮 鹽酸鹽 糖原,α-1,6 葡聚糖,糖元DDR1 Antibody5-羧基噻吩-2-酸 溴化乙錠(EB)PhosphoPlus® mTOR (Ser2448) Antibody Duet5-溴-1-甲基-1H-吲唑 貝西沙星鹽酸鹽Phospho-IGF-I Receptor β (Tyr1135) (DA7A8) Rabbit mAb2,6-二羥基-甲基吡啶 甜菜(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-IGF-I Receptor β (Tyr1135) (DA7A8) Rabbit mAb溴-2-氯三氟甲 甜菜Phospho-PSD95 (Tyr236/Tyr240) Antibody5-溴靛紅酸酐 尿酸Bag1 (3.10G3E2) Mouse mAb5-溴噻吩-2-甲 尿酸(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-AMPA Receptor 2 (GluA2) (Tyr869/Tyr873/Tyr876) Antibody鄰二甲酰甘氨酸 度米芬Phospho-AMPA Receptor 2 (GluA2) (Tyr869/Tyr873/Tyr876) AntibodyN-甲基-基 甜菜,一水Mcl-1 (D5V5L) Rabbit mAb氯吡啶-2,6-二羧酸 萘酚AS-D-乙酸酯SATB2 (E8R8H) Rabbit mAb2,9-二甲基-4,7-聯(lián)-1,10-鄰二氮雜菲 硫酸氯甲酯IGFBP2 Antibody3,6-二羥基鄰二甲 里氏埃里希氏體探針法熒光PCR檢測試劑盒白介素15(IL-15)ELISA試劑盒TIF1 gamma/Trim33 轉(zhuǎn)錄中介因子Tif1γ抗體100 ul 白介素13(IL-13)ELISA試劑盒Tissue factor 組織因子抗體100 ul 白介素12(IL-12/P70)ELISA試劑盒TFPI/LACI 組織因子途徑抑制劑抗體100 ul 白介素12(IL-12/P40)ELISA試劑盒TFPI-2 組織因子途徑抑制劑-2抗體100 ul 白介素11(IL-11)ELISA試劑盒TGF-alpha 轉(zhuǎn)移生長因子–α抗體100 ul 白介素10(IL-10)ELISA試劑盒TGF- Beta 1 轉(zhuǎn)化生長因子β1抗體100 ul 白蛋白ELISA試劑盒TGF-Beta 1 轉(zhuǎn)化生長因子β1抗體100 ul 艾杜糖硫酸酯酶(IDS)ELISA試劑盒TIEG1 TGF-β誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因1抗體100 ul 癌胚抗原(CEA)ELISA試劑盒TGF-beta 2 轉(zhuǎn)移生長因子β2抗體20 ul |