PCR技術的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 綿羊腺病毒探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Ovine Adenovirus | 貨號 | YSP97036 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結合到模板上,探針的結合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術解決了熒光染料與非特異性擴增結合的問題,反應結束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術的缺點: 成本高; 設計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術。該技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應的進行,PCR反應產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 鞘氨醇1酸酯受體1(S1PR1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 鉛色青霉 100g 分揀蛋白1(SORT1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 大麗輪枝孢 25g 淀粉樣蛋白β前體樣蛋白2(APLP2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 余速測盒(檢測范圍0~1mg/L) 500g 鈣離子轉運ATP酶A2(ATP2A2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) >97.0%(GC),含50ppm TBC穩(wěn)定劑 根瘤菌 1g 尿調蛋白(UMOD)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) >97.0%(GC),含50ppm TBC穩(wěn)定劑 大腸埃希菌 5g S100鈣結合蛋白A8(S100A8)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 10μg/g,基體:高純異辛烷/高純甲:99/1 細黃鏈霉菌乳糖變種 1ml S100鈣結合蛋白A9(S100A9)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 托姆青霉 1g 蛋白Z依賴性蛋白酶抑制因子(ZPI)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 克魯斯假絲酵母 5g 賴氨酰氧化酶(LOX)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥97% 鳳尾菇 1g 胞裂蛋白6(SEPT6)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 大豆慢生根瘤菌 100g 蛋氨酸腺苷轉移酶Ⅱα(MAT2α)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 醋酸鈣不動桿菌 25g GPI錨定分子樣蛋白(GML)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 雙孢蘑菇 5g B-細胞κ-輕肽基因增強子抑制因子激酶β(IκBKβ)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥95% (TLC) 發(fā)酵乳桿菌 1mg 核糖體蛋白L23A(RPL23A)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥95% (TLC) 柳利酵母 25mg 同線蛋白2(ST2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥95% (TLC) 汞對照液 5mg Endoglin蛋白(ENG)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥98% 球毛殼 1g CD19分子(CD19)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥98% 圣堡羅沙門氏菌 250mg 鉀中間小電導鈣激活通道蛋白亞家族N成員2(KCNN2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥98%(HPLC) 新疆鹽地桿菌 25mg 綿羊腺病毒探針法熒光PCR檢測試劑盒緊密連接蛋白12抗體Rabbit Meiiones Unguiculataus Milme-Edwauds/FITC 熒光素標記兔抗長爪沙鼠IgG100 ul CHIC2蛋白抗體Avidin/FITC 熒光素標記親合素1 ml 酸化細胞周期檢測點激酶1抗體Streptavidin/FITC 熒光素標記鏈霉親和素400 ul 酸化細胞周期檢測點激酶2抗體Donkey human IgG/FITC 熒光素標記驢抗IgG100 ul 酸化細胞周期檢測點激酶2抗體Donkey rabbit/FITC 熒光素標記驢抗兔IgG100 ul 酸化細胞周期檢測點激酶2抗體Donkey Goat IgG/FITC 熒光素標記驢抗羊IgG100 ul 酸化細胞周期檢測點激酶2抗體Donkey Guinea IgG/FITC 熒光素標記驢抗豚鼠IgG100 ul 遺傳性脈絡膜缺乏癥相關蛋白抗體rec Proin G/FITC 熒光素標記重組純化蛋白G100 ul 遺傳性脈絡膜缺乏癥相關蛋白樣抗體rec Proin A/FITC 熒光素標記重組純化蛋白A100 ul |